酸化劑主要包括單一酸化劑和復(fù)合酸化劑，單一酸化劑分為有機酸和無機酸。目前使用的無機酸化劑主要包括鹽酸、硫酸和磷酸，其中以磷酸居多。有機酸化劑主要有檸檬酸、延胡索酸、乳酸、丙酸、蘋果酸、山梨酸、甲酸、乙酸等。復(fù)合酸化劑是將2種或2種以上的單一酸化劑按照一定的比例復(fù)合而成，可以是幾種酸配合在一起使用，也可以是酸和鹽類復(fù)配而成，通過與飼料或水結(jié)合，動物食用后，能改善其消化道環(huán)境以滿足營養(yǎng)需要及疾病預(yù)防的需要[1]。下面將詳細說明飼料酸化劑中磷酸，檸檬酸，乳酸，富馬酸以及總酸含量的檢測方法。

1．磷酸的檢測

1.1磷酸的鑒別

磷酸是一種常見的無機酸，是中強酸，酸性強,在使用過程中極容易離解的特點；判斷飼料酸化劑中是否有磷酸可以用以下方法：

1.1.1試劑

氫氧化鈉溶液：4 0g/L 硝酸銀溶液，1 0 g/L 酚酞指示液：1 0 g/L

1.1.2 鑒別方法

稱取約1g試樣，置于100ml燒杯中，加10ml水，1滴酚酞指示液，用氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，滴加硝酸銀溶液，有黃色沉淀生成，該沉淀能溶于稀硝酸( 5 0 0 ) 或氨水。

1.2磷酸定量檢測方法—容量法

1.2.1 方法提要

根據(jù)磷酸性質(zhì)，以百里酚酞為指示液，用氫氧化鈉標準滴定溶液直接滴定，以確定磷酸含量。

1.2.2試劑

氫氧化鈉標準滴定溶液：約1mol/L；

百里酚酞指示液：1g/L

1.2.3 分析步驟

稱取約1.5克試樣，精確至0.0002克，移人250mL錐形瓶中， 加120mL水和5 滴百里酚酞指示液， 用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至淺藍色即為終點。

1.2.4 結(jié)果計算

磷酸( H3P O4) 含量的質(zhì)量分數(shù) W1 ， 數(shù)值以%表示， 按式( 2 ) 計算:

式中：

V — 滴定所消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積的數(shù)值，單位為毫升 ( mL )；

c — 氫氧化鈉標準滴定溶液濃度的準確數(shù)值，單位為摩爾每升( mo l / L )；

m— 試樣的質(zhì)量的數(shù)值，單位為克；

M— 磷酸 (H3P O4) 的摩爾質(zhì)量的數(shù)值，單位為克每摩爾 ( g / m o l ) ( M = 4 9 ) .

取平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值為測定結(jié)果; 平行測定結(jié)果的絕對差值不大于0.2%。

2．飼料酸化劑中總酸含量的測定：酸堿滴定法

2.1 方法摘要

根據(jù)酸堿中和原理，用堿液滴定試液中的酸，以酚酞為指示劑確定滴定終點。按照堿液的消耗量計算飼料中的總酸含量。

2.2 試劑與溶液：0.05mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液；1%酚酞溶液

2.3 分析步驟

精確稱取0.5克左右的飼料酸化劑樣品，置于250mL三角瓶中，加入50mL水及1%酚酞溶液2滴，氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至微紅色30S不褪色，記錄消耗0.05mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液的體積的數(shù)值（V1）。同一被測樣品應(yīng)測定兩次。

空白試驗：用水代替試液，按照上面步驟操作，記錄消耗0.05mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液的體積的數(shù)值（V2）。

2.4 結(jié)果計算

飼料酸化劑中總酸含量以質(zhì)量分數(shù)X計，數(shù)值以克每千克（g/Kg）表示,按式(1)進行計算：

式中：

C— 氫氧化鈉標準滴定溶液濃度的準確數(shù)值，單位為摩爾每升（mol/L）；

V1—滴定試液時消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）;

V2—空白試驗時消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）;

K—酸的換算系數(shù)：蘋果酸：0.067；乙酸：0.06；檸檬酸：0.064；檸檬酸：0.07（含一分子結(jié)晶水）；乳酸：0.09；鹽酸：0.036；磷酸：0.049；

M—試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）.

計算結(jié)果表示到小數(shù)點后兩位。

2.5 允許差

同一樣品兩次測定結(jié)果之差，不得超過兩次平均測定值的2%。

3 乳酸，檸檬酸的同時測定

3.1儀器：Agilent 1200型高效液相色譜，帶紫外檢測器

3.2試劑：乳酸 檸檬酸標準品 磷酸二氫鉀-磷酸緩沖溶液（0.1N，PH約為3）蒸餾水

3.3 色譜條件

色譜柱：XDB--C18 4.6×150mm 5um；柱溫：30℃；進樣量：10ul;流速1ml/min;檢測波長：215nm;流動相：0.1mol/L磷酸二氫鉀，磷酸調(diào)PH到3

3.4 樣品前處理：稱取適量樣品0.3—1.0克，加入100ml容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，0.45um濾膜過濾，上HPLC測定。

3.5乳酸、檸檬酸的測定

分別注射等體積20 μL的乳酸，檸檬酸標準溶液和樣品溶液進色譜，記錄色譜圖（乳酸，檸檬酸的保留時間大約是5min以內(nèi)）。記錄每張圖上乳酸，檸檬酸的峰面積響應(yīng)。

3.6 乳酸、檸檬酸含量的結(jié)果計算

乳酸，檸檬酸含量按式（2）計算：

式中：

X2——乳酸或者檸檬酸的含量，單位為克每百克（%）；

AU——乳酸或者檸檬酸在樣品中的面積響應(yīng)；

CS——乳酸或者檸檬酸標準樣品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；

AS——乳酸或者檸檬酸在標準品中的面積響應(yīng)；

WU——乳酸或者檸檬酸樣品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）

3.7 方法定量檢出限

本標準的方法定量檢出限為：0.2mg/Kg

3.8 允許差

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

4.富馬酸的測定

富馬酸（Fumaric acid）又稱反丁烯二酸，紫堇酸、地衣酸，延胡索酸。通常為白色結(jié)晶粉末，有水果酸味?；瘜W(xué)式是C4H4O4。為最簡單的不飽和二元羧酸。用于生產(chǎn)不飽和聚酯樹脂。

4.1原理

試樣經(jīng)緩沖液提取，固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜法檢測，根據(jù)保留時間和峰面積進行定性和定量。

4.2感官性狀：白色結(jié)晶顆?；蚍勰?，微溶于冷水，易溶于熱水。

4.3試劑和材料：磷酸：色譜純；蒸餾水；0.5%磷酸溶液:稱取0.495ml磷酸，加水至100ml溶解，經(jīng)0.45um濾膜過濾；蒸餾水：0.5%磷酸=9：1

4.4儀器和設(shè)備：高效液相色譜儀：配備紫外檢測器。

4.5色譜條件：色譜柱：色譜柱填充十八烷基硅膠，柱250×4.6 mm：流動相：蒸餾水：0.5%磷酸=9：1；流動相流速: 1 mL/min；檢測波長：205nm；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。

注：系統(tǒng)適用性為三次重復(fù)注入標準溶液所得到的面積響應(yīng)的相對標準誤差不大于2.0％。

4.6分析步驟

4.6.1 樣品溶液的制備

準確稱取50 mg的富馬酸樣品，置于100 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋到刻度，混勻，取10ml置于100 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋到刻度，混勻（含量>20%時）。

4.6.2 標準溶液的制備

準確稱取50mg富馬酸標準樣品，置于100 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋到刻度，混勻，取10ml置于100 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋到刻度，混勻。

注：因富馬酸微溶于冷水，易溶于熱水，蒸餾水應(yīng)加熱。

4.6.3 富馬酸的測定

分別注射等體積20 μL的富馬酸標準溶液和樣品溶液進色譜，記錄色譜圖（富馬酸的保留時間大約是3min）。記錄每張圖上富馬酸的峰面積響應(yīng)。

4.7 富馬酸含量的結(jié)果計算

富馬酸含量按式（2）計算：

式中：

X2——富馬酸的含量，單位為克每百克（%）；

AU——富馬酸在樣品中的面積響應(yīng)；

CS——富馬酸標準樣品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；

AS——富馬酸在標準品中的面積響應(yīng)；

WU——富馬酸樣品的質(zhì)量，單位為毫克（mg）。

4.8 方法定量檢出限

本標準的方法定量檢出限為：0.2mg/Kg

4.9 允許差

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

5．分析與討論

5.1 摸索檢測有機酸的實驗條件。實驗中發(fā)現(xiàn)采用C18柱分離有機酸時，乳酸和乙酸的保留時間基本上一致，無法分離，如下圖所示：

采用Grom-Sil 能較好的分離乙酸和乳酸[2]。馮向東等文章中[3]采用硫酸酮作為流動相，乳酸和乙酸的分離結(jié)果還是不理想，如下圖：

5.2 檸檬酸，乳酸和富馬酸可以同時測定，但是由于富馬酸微溶于冷水，易溶于熱水的特性，樣品前處理方法不一致，且有些飼料酸化劑含富馬酸較多，峰形太大；建議單獨檢測富馬酸，結(jié)果更準確可靠。

5.3除上面的檢測方法以外,還可以對酸化劑酸化特性進行體外評定:

（1）pH 值評定：將酸化劑配成1%水溶液，用磁力攪拌器攪拌均勻，用 pH 計測定其 pH 值，以 60 秒內(nèi) pH 計讀數(shù)不變記為溶液的 pH 值，每個酸化劑樣品測 3 個平行，取其平均值。

（2）緩釋能力評定：酸化劑產(chǎn)品緩沖能力定義：單位時間 pH 值變化量，pH/h。 稱取酸化劑樣品 1.0g，用 99.0g 去離子水配成 1%水溶液，將其置于 37℃水浴鍋中，保持恒溫。每隔 1 小時用 pH 計測其 pH 值一次，以 pH 計讀數(shù)在 60 秒內(nèi)不變記為溶液pH 值，按照仔豬吃一次日糧的時間間隔，一般食物在仔豬消化道內(nèi)停留約 6 小時左右，所以共測定 7 次溶液 pH 值，每個樣品測 3 個平行，取其平均值，做出變化曲線，從而反映酸化劑的緩釋情況。

（3）緩沖能力評定：稱取 1.0g 酸化劑樣品，用 99.0g 去離子水配成 1%水溶液，用磁力攪拌器攪拌均勻，加熱并保持在 37℃，將 pH 計電極探頭插入溶液中，然后向溶液中滴加 1mol/L 的 NaOH溶液，直到 1%酸化劑水溶液 pH 值改變一個單位，記錄 NaOH 溶液的消耗量，即為酸化劑 1%水溶液緩沖量。每個樣測 3 個平行，取平均值。

（4）對日糧系酸力的影響能力評定：首先測定日糧的基礎(chǔ)系酸力，測定方法：用燒杯稱取100g常規(guī)仔豬日糧風干樣，加入 200ml 去離子水，用磁力攪拌器攪拌均勻，呈漿狀液，接著用 1mol/L 的鹽酸溶液滴定至 pH 值為 4.0，記錄所消耗鹽酸的毫升數(shù)。然后用同上的方法測定加酸化劑后日糧的系酸力。

日糧系酸力改變量＝日糧基礎(chǔ)系酸力－加酸后日糧系酸力。

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